Questo progetto pilota è nato nel 2019 e si è concluso nel 2022.

OBIETTIVI Combinando genetica e biomeccanica, il progetto mirava a identificare prima di tutto nuovi marcatori di malattia che permettano la definire di nuovi protocolli diagnostici, da validare mediante caratterizzazione genetica degli stessi campioni.

DESCRIZIONE

La miopatia viscerale (VCMS), una forma miogenica di pseudo-ostruzione intestinale cronica, è una malattia genetica grave e molto rara che mostra disfunzioni, già in epoca neonatale, nella motilità vescicale e intestinale.

I piccoli pazienti affetti da tale disordine necessitano di una diagnosi precoce che permetta una tempestiva gestione della sintomatologia, rappresentata principalmente da una alimentazione parenterale, la malattia infatti non e’ al momento curabile.

Circa il 44% dei pazienti presenta mutazioni del gene ACTG2, mentre la causa genetica è sconosciuta per i restanti casi, affetti da sintomi simili e ancora non diagnosticati.

La mancanza di diagnosi, l’errata diagnosi o il trattamento inadeguato possono essere responsabili di eventi potenzialmente letali o di attacchi intestinali molto gravi e acuti.

Tali marcatori di patologia sono risultati, in una seconda fase, potenzialmente utili alla validazione di possibili trattamenti terapeutici specifici. Sulla base del grave difetto della peristalsi intestinale e del noto coinvolgimento del citoscheletro (ACTG2), nella maggior parte dei casi di VCMS, è stato ipotizzato che test biofisici per caratterizzare aspetti morfologici e meccanici possano esseri significativamente rilevanti per mettere a punto nuovi percorsi di diagnosi della malattia.

Sono stati pertanto predisposti test biomeccanici per valutare gli aspetti morfo-meccanici delle cellule, usando i fibroblasti come modello cellulare.

Tali analisi: 1) hanno fornito la base di informazioni per mettere a punto uno strumento diagnostico complementare alle valutazioni genetiche

2) sono state propedeutiche allo sviluppo di un approccio in vitro per verificare l’efficacia di potenziali terapie sulle cellule primarie.

Quei farmaci che hanno dimostrato di essere in grado di ripristinare l'elasticità o la forma delle cellule a livelli fisiologici possono infatti essere considerati per l’avvio di nuove terapie.

  IGG e CNR hanno fornito contributi complementari al progetto: da una parte il reclutamento dei pazienti e la loro caratterizzazione genetica, dall’altra la messa a punto di saggi biofisici e loro applicazione alle cellule dei pazienti. Presso la UOSD Laboratorio di Genetica e Genomica delle Malattie Rare (Istituto G Gaslini) sono stati raccolti una coorte di 36 pazienti sporadici e 5 famiglie con disturbi della motilità gastrointestinale neonatale / infantile e sono stati riportati varianti missenso eterozigoti nel gene ACTG2 in un totale di 19 probandi, da 19 famiglie non imparentate (46%). Colture primarie di fibroblasti sono state ottenute da campioni bioptici di un piccolo numero di pazienti CIPO, sia con che senza varianti ACTG2, mentre linee cellulari di fibroblasti già disponibili, sia da soggetti sani che affetti da malattie correlate o non correlate alla dismotilità intestinale, sono state utilizzate come controlli (tabella a fianco).

I fibroblasti sono stati coltivati in RPMI, con 10% di siero, PenStrep 1% e glutammina 1%. Le cellule sono state testate a passaggio omogeneo (tra il passaggio 3 e 5). Al fine di ottenere prestazioni simili su tutta la popolazione cellulare, è stato identificato un protocollo di sincronizzazione che è stato applicato a tutti i test, ad eccezione della migrazione in cui la fase di sincronizzazione è stata sostituita con la soppressione della proliferazione.

Elasticità cellulare Il modulo elastico cellulare è stato acquisito tramite nanoindentazione di singola cellula, eseguita con sistema Chiaro (Optics11Life, NL). L'acquisizione dei dati è stata effettuata su almeno 3 replicati per campione e per ogni linea cellulare sono state eseguite almeno 100 indentazioni.

Migrazione cellulare La capacità di migrazione dei fibroblasti è stata valutata mediante scratch test. Al fine di standardizzare la procedura, sono stati utilizzati setti IBIDI, che garantiscono l'omogeneità nello “scratch”. Per valutare il solo contributo della migrazione nella ‘chiusura della ferita’, è stato utilizzato un reagente antimitotico (Ara-C), che riduce drasticamente la proliferazione. Sono stati preparati almeno 3 replicati per tutte le linee cellulari, con e senza Ara-C. Gli esperimenti sono stati eseguiti durante 31 ore, acquisendo immagini cellulari in media ogni 4 ore.

Morfologia cellulare Un sistema di olografia digitale (M3, Phiab, SE) è stato utilizzato per valutare le caratteristiche morfologiche 2D e 3D di una singola cellula. Sono state acquisite circa 30 immagini cellulari di cellule adese, sincronizzate, a bassa confluenza. Le immagini sono state analizzate con il software Holomonitor (Phiab, SE).

Forza di trazione cellulare La microscopia a forza di trazione (TFM) è stata eseguita per valutare la capacità di singola cellula di esercitare trazione su un substrato. La tecnica si basa su substrati con griglie di punti fluorescenti sviluppati all'ETH (Zurigo, CH), su cui le cellule sono state piastrate per 18 ore. La deformazione del substrato è stata rilevata in microscopia a fluorescenza e le immagini acquisite sono state analizzate attraverso un approccio software implementato in ETH (Zurigo, CH). Le immagini sono state acquisite su almeno 3 replicati di ciascun campione.

Statistiche Al fine di verificare se le caratteristiche estratte dalle analisi fossero in grado, con significatività e robustezza statistica, di distinguere tra casi VSCM e controlli, sono stati eseguiti il test t di Student, in caso di distribuzione gaussiana dei valori, o test non parametrici come il test di Kruskal – Wallis e il test di Wilcoxon, in caso di distribuzioni non normali. Solo quando il valore p è <0,05 (o 0,01 nell'analisi più robusta), i risultati sono stati considerati adeguati per definire il potere discriminante  della proprietà valutata.

RISULTATI

Prima di tutto è stata valutata l’espressione del gene ACTG2 nei fibroblasti, confermata mediante esperimenti in real-time da retrotrascritti di linee cellulari con reagenti adeguati.

Dai risultati finora raggiunti possiamo concludere che:

1. I fibroblasti cutanei possono essere considerati un modello affidabile per VSCM, almeno per VSCM causata da ACTG2. Sebbene ACTG2 non sia tipicamente espresso nel tessuto cutaneo né nei fibroblasti, una quantità di trascritto ACTG2 è stata trovata nei fibroblasti cutanei a disposizione del nostro studio. Inoltre, nonostante il basso livello di espressione, le mutazioni ACTG2 sembrano influenzare il comportamento morfomeccanico delle cellule.

2. La valutazione della biomeccanica cellulare, comprese le caratteristiche morfologiche e meccaniche delle cellule, è stata in grado di evidenziare alcuni parametri che, in fibroblasti cutanei, mostrano valori diversi nelle linee cellulari affette da VSCM e nelle linee cellulari di controllo, sia sane che provenienti da individui con condizioni non VSCM. I risultati più notevoli e promettenti riguardano la forza di trazione cellulare (TFM):  tale parametro è stato in grado di separare chiaramente i campioni affetti da VSCM dai campioni di controllo, indipendentemente dalla mutazione causativa e dal gene affetto. Anche la capacità di migrazione cellulare è emersa come parametro interessante, dimostrando che le linee cellulari affetta da VSCM sono in grado di migrare più rapidamente di quelle di controllo. Tuttavia, non è chiaro come cellule scarsamente in grado di esercitare una forza di trazione possano poi migrare più rapidamente di quelle di controllosane, e questo sarà certamente oggetto di studi a venire. Al contrario, il modulo elastico cellulare sembra, sula base delle analisi finora condotte, non rappresentare una caratteristica cellulare in grado di discriminare tra linee cellulari affette e quelle di controllo. Per quanto riguarda la morfologia cellulare, tra le caratteristiche di forma valutate lo spessore massimo cellulare di cellule adese appare in grado di distinguere i fibroblasti della popolazione di controllo dai fibroblasti VSCM.

I risultati ottenuti appaiono molto interessanti, sia per scopi diagnostici che per supportare lo sviluppo di una terapia per VSCM. In particolare, per quanto riguarda la diagnosi di VSCM causata da geni non ancora noti per essere associati a tale disturbo, i risultati presenti potrebbero essere particolarmente utili, consentendo la messa a punto di specifici test diagnostici sui fibroblasti cutanei da accoppiare all'analisi genetica. 

Test su nuove molecole

I risultati sopra riportati rappresentano anche la base per testare l'efficacia di nuove molecole, con potenziali effetti benefici sulla VSCM. In quest'ottica è stata più recentemente avviata un'ulteriore parte del progetto, che si occupa dell'identificazione e del test di molecole potenzialmente in grado di ripristinare le corrette caratteristiche morfo-meccaniche fisiologiche nelle linee cellulari provenienti da pazienti VSCM.

È stato quindi selezionato un piccolo insieme di molecole, identificate sulla base di affinità degli effetti richiesti, vicinanza ai sintomi della malattia o coinvolgimento nel silenziamento dell'allele mutante. A questo scopo, abbiamo effettuato esperimenti per valutare la tossicità e per trovare la dose da somministrare ai fibroblasti, delle seguenti molecole:

• 17-Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamicin (17-DMAG), un analogo della Geldanamicina, è un potente inibitore dell'HSP90. Nell'ipotesi che il mutante ACTG2 non sia in grado di ripiegarsi correttamente nel citoscheletro, DMAG potrebbe esercitare un effetto benefico aumentando la risposta delle Heat Shock Proteins (HSP)

• Curcumina: è un estratto dalla Curcuma longa con numerosi e riconosciuti effetti benefici, aumenta la risposta HSP

• La carbamazepina (CBZ), una dibenzazepina, è un composto triciclico utilizzato nel trattamento dell'epilessia, della nevralgia del trigemino e dei disturbi psichiatrici, in grado di aumentare la degradazione proteica tramite autofagia

• Ceftriaxone (CEF) è un antibiotico, già dimostrato ridurre gli aggregati intracitoplasmatici di specifiche proteine mutanti (es.: GFAP) attraverso l'eliminazione della proteina mutante che coinvolge, tra l'altro, l’aumento di HSP27 e αB-Crystallin, della poliubiquitinazione e autofagia.
  

I test sull’efficacia di un paio di tali molecole nel riportare i valori dei parametri di migrazione dei fibroblasti VSCM ad assomigliare a quelli dei fibroblasti di controllo sono attualmente in fase di sperimentazione, come misura della potenziale capacità di queste molecole di agire sugli effetti biomeccanici della malattia appena identificati.

Per le mutazioni eterozigoti, che possono produrre un effetto di "guadagno di funzione", come le varianti ACTG2, il knockdown della trascrizione e dunque della proteina mutata può rappresentare un potente approccio terapeutico, non solo fattibile ma anche promettente. Quindi, i dati mutazionali del gene ACTG2 suggeriscono, come opzione di trattamento alternativo per VSCM, la fattibilità del knockdown selettivo del trascritto mutante utilizzando AntiSense Oligonucleotides (approccio ASO), come già perseguito in altre malattie dominanti. Questo approccio è in fase di sperimentazione in vitro su fibroblasti VSCM, utilizzando un kit Qiagen che è stato identificato per la potenziale adeguatezza a tale protocollo.

Anche nel caso di utilizzo di ASO, verranno applicati specifici test già stabiliti (vedi sopra) per vedere se a seguito si somministrazione la biomeccanica delle cellule trattate viene modificata fino a riportare i marcatori cellulari a valori normali, verificando così l'efficacia del potenziale trattamento sulle cellule affette da VSCM.

FONDI DESTINATI 70.000€ per il 2019

50.000€ per il 2021